КАТЕГОРИИ:


клетка криоконсервация

лекция 15

Цел: да се изследва методи за съхраняване на клетъчните култури, предимствата на криоконсервация на растителни клетки, основните етапи, както и трудностите, срещани във връзка с особеностите на растителни клетки.

План на лекцията:

1. Бавно клетъчен растеж

2. Основните етапи на криоконсервация

2.1 Получаване на културата

2.2 Замразяване и съхранение

2.3 Размразяване и премахване на криопротектор

2.4 рекултивиране клетки и оценена след криоконсервация

1 Към момента на създаването на нови сортове растения и редовна смяна, което се дължи преди всичко със загубата на разнообразие от функции, появата на нови популации от вредители и болести, изменението на климата, почвата и най-различни други причини. Средната продължителност на живота на сортове пшеница и други зърнени култури обикновено е 5-10 години. Да се ​​разработят нови сортове и подобряване на стари изисква разнообразие на генетичен материал. За да се запази генофонд на редки и застрашени видове на местата за размножаване и щамове - производители на икономически важни вещества разработени методи за създаване на колекции и ин витро генни банки.

Основният източник на гени са семена. За да създадете нови клетъчни линии. синтезиране на ценни продукти, необходимостта да се съхранява колекция от клетки, която е на стандарти за производство на клетки, които имат определени характеристики. За да се изследва физиологични и биохимични процеси в култивирани клетки става необходимо да се запази постоянно оригиналните стандартни клетъчни линии. По този начин, за да отговори на предизвикателствата, необходими за съхранение на методи за клетъчни култури. Има два подхода към решаването на този проблем: (. От гръцките kgyos - "студен", "лед") инхибиране на клетъчния растеж и съхранение в замразено състояние, т.е. криоконсервация. Предизвикателството е да се промени кинетиката на растеж на културата и да увеличи времето между трансфери. Това би позволило на културата трансплантация на всеки 3-4 месеца, една година или дори по-рядко. В момента забавяне повлияни от фактори, които ограничават растежа, постигнат само за културите, пуснали и регенерирани растения.

Най-ефективният начин за забавяне на растежа е да се намали температурата на култивиране в комбинация с намалена светлина. Изборът на температура се определя от вида на устойчивостта на растенията към студ. По този начин, за депозиране картофени колекции използва температура от 10 ° С и 1 ° С ябълка препоръчва за култури обикновено растат при 20 - 25 ° C, да се използва 4-10 С

На растежа на растенията може да се забави добавянето на хранителна среда osmotikov - манитол и сорбитол, захароза концентрация увеличава или въвеждане в културална среда на вещества, които инхибират растежа на. В миналото е била използвана като хидразид малеинова киселина, 2,2-metilgidrazid hlorholinhlorida янтарна киселина, абсцисова киселина. В изключително редки случаи, използването на по-бавен растеж намалява кислорода - хипоксия. Създаване на условия хипоксия се използва смес от 90% азот и 10% кислород. Понякога се намали концентрацията на кислород и едновременно намаляване на атмосферното налягане. С цел предотвратяване на изчерпване на хранителните вещества и дехидратация обем на среда за дозиране да се забави да отглеждат земеделски култури се увеличи. Ако използвате течна среда, то долива от време на време, тъй като тя е активно се изпарява.



2 криоконсервация - дълбоко замразяване и съхранение на много ниски температури, например при температурата на течния азот (-196 ° С). Тази температура осигурява стабилно поддържане на генетичните характеристики на обекти в практически всяка дължина. Този метод позволява да съхранявате най-различен материал - от изолирани протопласти за ембриони и семена. В момента, дълбоко замразяване клетки, тъкани и органи е широко разпространено в медицината и животновъдство. Положението е различно, с растителен материал. Основните трудности са свързани със спецификата на растителната клетка и чрез процес на дълбоко замразяване. Растителните клетки с големи размери, голям вакуола и много вода, повече повредени чрез замразяване и последващо размразяване. Cell увреждане, дължащо се на образуването на лед, както в клетки и отвън. Ice обикновено се формира за първи път през външния разтвор около клетките. Цитоплазма точка на замръзване на минус 1 ° С, но клетките не са замразени до около 10-15 ° С, тъй като до този плазмалемата допълнително предпазва от проникване на ледени кристали, растящи в външния разтвор. Растежът на ледените кристали в клетъчната мембрана го унищожава.

Ако температурата намалява бавно, клетка успява загуби част на свободната вода, която оставя на повърхността и замръзва бавно растящи кристали във външния разтвор. Това не е придружено от бързо замразяване и дехидратация води до ледени кристали в цитоплазмата. Бавно замразяване може напълно да се премахне водата кристализация в клетката, но неизбежно възниква значителна дехидратация и компресия протоплазма. Обезводняване случва, защото клетките на външен концентрацията на разтвора се дължи на образуването на лед в него. Прекомерното плазмолиза като им осмотичен стрес (особено при последващото deplazmolize) води до клетъчна смърт.

По този начин, причина за клетъчна смърт по време на замразяване е образуването на вътреклетъчен лед и механични повреди на мембраната, и осмотичен стрес, причинен от силни дехидратация клетки. Следователно, всички използвани в криоконсервация методи, насочени към определен баланс както вредни фактори. Оцеляването на растителни клетки, зависи от редица условия: генетични и морфологични и физиологични характеристики и тяхната способност за студено втвърдяване, състава и количеството на естествени или изкуствено добавени криопротектори, степента на пропускливост на тези вещества и скорост на намаляване на температурата на водата и условия размразяване.

Работата по криоконсервиране на клетъчната култура се състои от следните етапи (Фигура 18): - получаване на клетъчна култура,

- добавяне на криопротектор,

- софтуер замразяване,

- съхранение в течен азот,

- бързо размразяване,

- отстраняване на криопротектор,

- рекултивиране и регенерация на растенията.

Фигура 18. Етапи криоконсервация на клетъчни култури

2.1 Нека разгледаме основните етапи на криоконсервация на клетките. Експериментално възможност за съхранение при ниски температури култивирани клетки изолирани меристем, стреля върха, ембриони, полен. Въпреки това, за криоконсервиране на такива различни предмети, разбира се, изисква различни подходи и условия, считано от началния етап на експлоатация. Най-доброто от всички техники за криоконсервация разработен за окачване култури. Meristemoidnye малки клетки са по-устойчиви на замразяване от големи вакуолен клетки. Същото се отнася и за фина суспензии насипни агрегати на клетки, в сравнение с големи гъсти маси клетки. Клетките тропически видове растения могат да бъдат по-малко стабилни от растителните клетки на умерения пояс. При по-сложни организационни структури, като например меристема, ембриони, embryoids се изисква да се оптимизират условията на всеки етап. От особено значение е специално обучение култура, която има за цел да обогати меристематични клетъчен тип. Дългосрочна култивиране в osmotike, синхронизация на клетъчното делене, намаляване на сроковете за трансплантация помогне за намаляване на размера на клетката и да се увеличи тяхното оцеляване. В някои култури положителен ефект върху клетъчната жизнеспособност преди осигуряване


предварително култивиране с някои аминокиселини чрез повишаване на ендогенните нива на захар в клетките. За суспензионни култури е важен аспект на препарати за концентрация.

2.2 Криозащитни - са вещества, които намаляват точката на замръзване, за да се свърже вътреклетъчния вода и защитават клетките от механични и осмотичен стрес. Те включват диметил сулфоксид (DMSO), глицерол, пролин и захароза, която е растение, естествено криопротектор. Криозащитни себе си може да предизвика осмотичен стрес, така че те избрани оптималните концентрации и комбинации.

DMSO има уникална способност на проникване, това е особено важно за големи плътни организирани структури, като например меристеми. За тяхното получаване етап се състои главно в предварително култивирани в среда, допълнена с 5% DMSO. Това гарантира създаването на ефективни концентрации на криопротектори около върха на размер от около 0,3-0,5 мм.

Заедно с избора на криопротектори, и това е за тези клетки, е важно да се намери оптималната програма замръзване. Разграничаване бавно постепенно замразяване, бързо и ултра-бързо. При бавно постепенно температурата на замръзване в границите от 0 до около - 40 ° намалява в размер на 0.5-1 минути. Когато бързо съоръжение замразяване в ампула с криопротектор веднага се потапя в течен азот. В ултрабързи замразяване на обекта се инжектира директно в течен азот. Прашец може да бъде замразен в суха форма, в специален запечатана пластмасова ампула от тях потапяне в течен азот. Данните, получени Cryobank на IGF в Москва показват, че бо Лий успешен резултат дава програмираната замръзване. Това изисква специален дизайн с работната камера, охлажда при програмирана скорост на въвеждане на течен азот изпарения.

2.3 Размразяване и възстановяване на растежа на културите - отговорност и често критични стъпки на процеса. С твърде бавно размразяване клетките в тях има повтаряща формация лед, да доведе до увреждане. Бързо размразяване предотвратява това. Размразяване продукция потапяне флакон в топла баня (40 ° С) за замразено или накапване Предмети на топла вода или културална среда. Въпреки това, в изключителни случаи, по- подходящо е бавно размразяване.

След размразяването криопротектори се отстранява, което обикновено се прави на студено. По-голямата част от физическите промени се срещат в клетките по време на замразяване и размразяване, но само, че Размразените клетки са силно чувствителни към по-нататъшно увреждане и поради това изискват внимателно "сестрински". Тя започва с по Пресаждането клетки директно на редуцираща среда без измиване с опазване на клетки в криозащитна. криопротектор често отстранява специални условия на измиване.

2.4 Състояние на култури е трудно да се прецени, когато материалът е на криоконсервация. Оценяването се извършва след размразяване и необходимостта от използването на култури. Тестовете са най-подходящи за бързи култури оценка


жизнеспособност. Тестове за предпочитане се извършва веднага след размразяване, и на следващия ден. Тестове, проведени периодично по време на повторен растеж за мониторинг на увеличаването на съдържанието на жизнеспособни клетки или жива тъкан.

За пробите, които са видими под микроскоп при преминаваща светлина, т.е.. Е, клетъчни суспензии, протопласти, калус и малки организационни структури, използвайте fluorestseindiatsetatom оцветяване fenosafraninom. За мазоли и дебели големи организирани структури използва тетразолиево сол.

Оцеляване е количествена оценка на растежа. Изследване на растежа на култивирани клетки при използване на някой от стандартните методи за измерване на растежа, включително мокро и сухо наддаване на тегло, размер на депозираните клетки, оптичната плътност на клетки, директно микроскопско наблюдение. Стандартни цитологични методи позволяват да се оцени степента на увреждане и възстановяване процес срещащи се в тъканите. Дори и по-точни данни се получава в изследването на ултрастурктура чрез електронна микроскопия.

Като се има предвид хетерогенността на клетъчните култури, като ги подготвя за замразяване, не може да се изключи напълно възможността за съществуване на селективни предимства за някои подгрупи от населението, по-специално в ниската степен на преживяемост след размразяване. Затова има нужда от генетични, физиологични и биохимични проверка.

В етап рекултивиране понякога използват известни техники засилване на клетъчния растеж се избегне избор на възможните студено толерантни мутантни клетки. Установено е, че за съхранение в течен азот няма ефект върху оцеляването и подновяване на клетъчни култури. идентичен на оригинален клетъчната култура и са полезни за биотехнологични приложения регенерирани след съхранение в течен азот.

Така cryobank клетки, меристеми, прашец осигурява съхраняването на генофонд не само култивирани ин витро-продуциращи щамове, но и редки и застрашени видове, което е особено важно за вегетативно размножени растения.

Контролни въпроси:

1. Методи за генетичен опазване ин витро.

2. Какви са предимствата на криоконсервация на клетките?

3. Какво е криопротектори?

4. Получаване на клетките за криоконсервация.

5. Как е замразяване и размразяване на клетките?


Позоваването

1. Valikhanov GJ Растителните биотехнологии. -Almaty: Konzhyk, 1996.- 272 стр.

2.Andreeva A. Biotechnology. -Karaganda 2000 година.

3. Приходко NA, Zimin VN Биотехнологии mikroorganizmov.-Shymkent, 2006.-204 с.

4. Mukhametzhanov SK Valikhanov GJ, Erezhepov AE Методическо ръководство за лабораторни изследвания на тъканни култури и биотехнологии rasteniy.-Shymkent, 2007.-108 с.

5. Калинин Флорида, Sarnatsky VV, Polishchuk VV методи на култивиране
тъкани и клетки в растителна физиология и биохимия. -Kiev Naukova Dumka,
1980 година.

6.Valihanova GJ, Rakhimbaev IR, Karzhasova AV Bishimbaeva NK
Методическото ръководство за практическо обучение в тъканна култура
растения. -Alma Ата KazGU 1983.

7.Kataeva PV Butenko RG Клонираните микроразмножаване rasteniy.-
М:. Наука, 1983.

8.Gleba YY, Sytin да KM Cell инженерни растения. -Kiev:
Naukova Dumka 1984 година.

9.Butenko RG Културата на растителни клетки и биотехнологията. -M: Наука,
1,986.

10. клетъчно инженерство / Butenko RG, Gusev MB., Kirkin AF
Biortehnologiya, Т. 3. -M. Гимназия по 1987.

11. Plant Biotechnology: клетъчна култура. - М;
Agropromizdat 1989 година.

12.Muromtsev GS, Butenko RG .. Tihonenko GI Porofev MI
Основи на биотехнологиите в селското стопанство. -M. Agropromizdat, 1990.

13. Лабораторни и практически упражнения върху земеделски
Биотехнологии: Указания / GM Артамонов, SI. Герасимова,
ST. Degtyarev, EZ Kochieva, DV Калашников, IK Blinovskii, LI
Hrustalsva. Ед. Акад. VASKhNIL BC Sheveluhi.- M:. ICCA 1991.

14. Калинин FL, GP Kushnir, В. Sarnatsky технология
микроразмножаване на размножаване на растенията. -Kiev Naukova Dumka 1992.

15. Heslop-Hamson J., Dodds JH, Roberts ЛУ Експерименти в растителните
Тъканни култури. Cambridge University Press, 1995.

16. Gamborg OL, Phillips GC Plant Cell, Tissue и органна култура.
Springer-Veiiag 1995 година.

17. Смит RH растителна тъкан културата: Техники и експерименти.
Academic Press, 2000.

18. Основи на биотехнологиите в селското стопанство. -M. Agropromizdat. 1990.-384 с.

Mamyrbekova Aigul Kumekbaevna, Abubakirova Азхар Abdugapparovna

растителните биотехнологии

редактор

Подписано печат

Размер на хартията X х Y 1/16

Печатарски хартия. Офсетов печат. Том ... пл.

Тираж ... .ekz. Номер на поръчката ... *

© Публикуването на Държавния университет на Южна Казахстан

тях. M.Auezov

Издателство Център SKSU. Auezov, Shymkent и др Tauke Хан 5

<== предишната лекция | Следващата лекция ==>
| клетка криоконсервация

; Дата на добавяне: 01/04/2014; ; Прегледи: 948; Нарушаването на авторски права? ;


Ние ценим Вашето мнение! Беше ли полезна публикува материал? Да | не



ТЪРСЕНЕ:


Вижте също:



ailback.ru - Edu Doc (2013 - 2017) на година. Не е авторът на материала, и предоставя на студентите възможност за безплатно обучение и употреба! Най-новото допълнение , Ал IP: 66.249.93.207
Page генерирана за: 0.025 сек.